一、样品提取
准确称取鱼肉样品5 g（精确至0.01 g）于塑料离心管中，加入10 mL 1%乙酸乙腈溶液，涡旋1 min后，35 ℃超声提取10 min，加入5 g无水硫酸钠5 g，涡旋1 min后，10000 r/min离心5 min，移取上清液于干净离心管中；
残渣再加入10 mL 1%乙酸乙腈溶液，涡旋混匀5 min，10000 r/min离心5 min。合并两次提取液，混匀后40 ℃氮吹至0.5mL左右，加入乙腈1 mL，涡旋混匀充分溶解残渣，加入水5 mL，涡旋混匀，作为待净化液。
注：提取液氮吹后加乙腈一定要复溶完全，观察管壁是否有残留；加水稀释后，需尽快上柱，经验证发现放置时间过长易析出絮状沉淀，造成目标物损失严重且过柱速度慢。
二、样品净化 Copure® HLB SPE & QuEChERS净化管
活化：HLB 固相萃取柱（货号：COHLB360）依次用5mL甲醇和5mL水活化。
上样：取上述待净化液过柱，控制流速不超过1 mL/min。
淋洗：用5 mL水淋洗小柱，挤干小柱，弃去流出液。
洗脱：加入10 mL乙腈洗脱小柱，收集洗脱液。
复溶：全部洗脱液于40 ℃下氮吹至近干，准确加入1 mL复溶液溶解残渣，加入入PSA吸附剂150 mg（货号：COQ002144H），涡旋1 min，8000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm亲水PTFE滤膜，供LC-MS/MS 测定。
复溶液配制：取甲酸1 mL，用60%乙腈水溶液稀释至1 L，混匀。
三、 标准工作液配制
选同类型鱼肉空白样品5份，按照上述1、2提取净化后所得洗脱液，分别向洗脱液中加入适量的地西泮标准中间液，于 40 ℃下氮吹至近干，准确加入1 mL复溶液溶解残渣，加入PSA吸附剂150 mg（货号：COQ002144H）涡旋1 min，8000 r/min 离心5 min ，取上清液过微孔滤膜，配制成地西泮浓度为1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的系列基质匹配标准溶液，供液相色谱-串联质谱仪测定。
四、仪器条件
仪器：UPLC-MS/MS（ Thermo Fisher TSQ Endura）
色谱柱：Copure®兽残专用柱（2.1 mm×100 mm，3μm）
流动相：A：0.1 %甲酸 B：乙腈
洗脱方式：梯度洗脱，见表1
流速：0.25 mL/min
柱温：35 ℃
进样量：15 μL
表1 梯度洗脱程序
质谱条件
离子源：HESI
电喷雾电压：3500 V
鞘气压力：40 arb
辅气压力：2 arb
离子传输管：380 ℃
辅气温度：350 ℃
表2 各组分名称、定性、定量离子对
五、实验结果
表3 鱼肉基质地西泮加标回收实验结果
六、 优化Tips
① 实验验证发现地西泮氮吹损失较大，因此在配制标准曲线时，将标准品加入到空白基质洗脱液中氮吹后复溶所得，校正氮吹损失。
② 地西泮脂溶性很强，不溶于水且容易附着于离心管壁，上样液上柱后需观察离心管壁上是否残留不溶油状物。
③ 此次方案提取方式为二次提取，对于低浓度加标，一次提取和二次提取的回收率相差较小；但对于高浓度加标样品，二次提取回收率相较于一次提取可提升10%；实验室可根据自身加标情况，选择一次提取或者二次提取。
七、 订购信息
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