1、 样品提取
称取粉粹均匀的草鱼样品2 g，加入10 mL 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液；
涡旋混匀1 min，超声提取10 min，再涡旋混匀1 min，5℃ 10000 r/min离心5 min，移取上清液至另一塑料离心管中；
残渣再用8 mL 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液按上述方法重新提取一次，合并提取液，混匀后用0.01 moL/L磷酸盐缓冲液定容至20 mL；
准确移取5 mL上述定容后的提取液至另一个新塑料离心管中，用氨水调pH至7.0~7.5，加入5 mL三氯甲烷，充分涡旋混匀1 min，4000 r/min离心8 min，取上清液待净化。
注：
①0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钾1.36 g，980 mL水溶解，用1 mol/L 盐酸调节pH至4.0，分别加入乙二胺四乙酸二钠0.15 g和三氯乙酸20.0 g，溶解并定容至1000 mL。
②移取提取液加氨水调节pH至7.0~7.5时，可以选一个空白样品准确用移液枪逐步添加氨水调节至pH合适时，记下相应氨水体积，避免每个单一样品均调节pH；氨水少量多次调，切记不要调到 pH＞8，调完尽快上样，不要在碱性提取液长时间放置，样品过碱会导致提取液有絮状物质析出，并导致苷键水解致使回收率降低。
02 样品净化 Copure® 氨基糖苷分子印迹柱/C18 SPE
活化：氨基糖苷分子印迹柱依次用2 mL甲醇和2 mL 50 mmol/L 磷酸二氢钾溶液水活化。
上样：取上述待净化液加入活化好的氨基糖苷分子印迹柱中。
淋洗：依次用3 mL水，3 mL乙腈淋洗小柱，抽干。
洗脱：C18固相萃取柱依次用5 mL甲醇、5 mL水预活化后，串接在氨基糖苷分子印迹柱下方，向其中加入3.5 mL 80%乙腈溶液，收集流出液于10 mL塑料离心管中，待80%乙腈溶液流尽后再向柱中加入1.5 mL 80%乙腈溶液，待全部洗脱液流尽后吹干小柱弃去；收集全部洗脱液于同一塑料离心管中，45 ℃下氮吹至近干，加入1 mL复溶液溶解残渣，复溶超声1 min后涡旋混匀，过0.22 μm亲水PTFE滤膜后收集于PP样品瓶中，上机测试。
注：
①50 mmol/L 磷酸二氢钾溶液：1.7 g磷酸二氢钾，240 mL水溶解，用5 mol/L氢氧化钾溶液调pH至7.5，定容至250 mL。
②80%乙腈溶液：量取乙腈400 mL、水100 mL、甲酸 5mL、七氟丁酸325 μL，混匀。
③复溶液：0.1%甲酸乙腈溶液：10 mmol/L甲酸铵（含0.1%甲酸）=9：1。
03 标准工作液配制
选同类型鱼肉空白样品，每份2 g于50 mL塑料离心管中，分别加入10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、200 μL、400 μL 混合标准中间液（4 mg/L)，按上述前处理方法进行操作，配制成系列基质添加标准工作液，使最终各类药物上机浓度分别为10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL。
04 仪器条件
仪器：UPLC-MS/MS（ Thermo Fisher TSQ Endura）
色谱柱：Copure®氨基糖苷专用Hilic柱（2.1 mm×150 mm，3 μm），货号：HAGS414
流动相：A：10 mmol/L 甲酸铵溶液（含0.1 %甲酸） B：含0.1 %甲酸的乙腈溶液
洗脱方式：梯度洗脱，见表1
流速：0.5 mL/min
柱温：35 ℃
进样量：15 μL
质谱条件：
离子源：HESI
电喷雾电压：3500 V
鞘气压力：40 arb
辅气压力：2 arb
离子传输管：380 ℃
辅气温度：350 ℃
05 实验结果
实验结果如下：
06 优化Tips
①不同的色谱柱优化的液相及质谱条件不同，需适当调整流动相浓度及组分，以确保11种氨基糖苷类物质响应达到最优。
②氨基糖苷类物质基质抑制很强，校正曲线需要按照标准配制添加曲线。
③氨基糖苷属于强电离物质，且容易被金属管路吸附，最好配备特定PP管路；若没有条件，可以在进样之前通过进高浓度点样品使管道吸附达到饱和。
④实验验证发现：普通玻璃由于存在游离的硅烷基会对氨基糖苷类物质存在较强吸附，实验中耗材应尽量避免玻璃制品，如玻璃氮吹管和玻璃样品瓶。
07 订购信息
