一、实验目的
本法为以Copure HLB(60mg/3mL)柱开发的针对动物源食品(猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品)中硝基呋喃类代谢物残留检测的样本前处理净化方法，HPLC法作为检测手段。Copure™ HLB(60mg/3mL)柱净化效果良好，回收率满足测试要求，重现性好，与知名厂商同型号柱性能相当。
二、实验目标物
四种硝基呋喃类代谢物：呋喃它酮代谢物5-吗啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮(缩写AMOZ, CAS:43056-63-9)、呋喃西林代谢物氨基脲(缩写SEM, CAS:563-41-7)、呋喃妥因代谢物1-氨基-2-内酰脲(缩写AHD,CAS:2827-56-7)和呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-噁唑烷基酮(缩写AOZ, CAS:80-65-9)。
三、应用范围
本方法适用于动物源性食品包括猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品(鱼类、虾蟹类和贝类)中硝基呋喃类代谢物残留检测。
四、参考标准
《GB/T 20752-2006 猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》和《农业部1077号公告-2-2008 水产品中硝基呋喃代谢物残留量的测定》。
五、实验材料
biocomma® Copure® HLB固相萃取柱60mg/3mL(Cat.No.COHLB360)；W品牌HLB固相萃取柱60mg/3mL。
六、实验方法
1、样品待测溶液制备
(1) 样品称取脱脂
称取待测样品2 g(精确到0.01 g)，置于50 mL离心管中加入10 mL甲醇-水混合物(2:1)，振荡混匀10 min，4000 r/min离心10 min，吸取清液弃掉、离心管中试样备用。
(2)水解衍生化
向上述离心管中加入20 mL0.2 mol/L盐酸，振荡混匀10 min，后加入0.4 mL 0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛(0.075 g2-硝基苯甲醛溶于10 mL 二甲亚砜)，涡旋混匀1 min，置于37 ℃恒温振荡器水浴中避光反应16h。将上述衍生液，放置至室温，加入5 mL0.1 mol/L磷酸氢二钾溶液，用1 mol/L NaOH调节pH到约7.4，4000 r/min离心10 min，上清液(对脂肪含量多的试样，可加入5 mL正己烷，振荡2 min，4000 r/min离心5 min吸取并弃掉正己烷)待净化。
2、SPE柱净化
(1)活化：依次用5 mL甲醇、10 mL水活化。
(2)上样和洗脱：取上述备用液控制流速小于2 mL/min过柱。待样液全部通过后用10 mL水淋洗上样柱，弃去全部流出液并真空抽干，最后用5 mL乙酸乙酯洗脱柱子上的待测成分。
(3)重新溶解：收集洗脱液，于40 ℃氮气吹干，准确加入1 mL 乙腈/水(1:2, v/v)溶液溶解残余物混匀，0.22 μm滤膜过滤，供高效液相色谱测定。
3、HPLC条件
设备：Waters Alliance 2695
色谱柱：Welch Ultimate XB-C18 (250×4.6mm，5 μm)
检测器：Waters 2487 双波长检测器；检测波长：275nm
流动相：A:乙腈 B:0.01mol/L乙酸铵（0.77g乙酸铵，1000 mL水溶解，甲酸调pH 3.5 ）
洗脱方式：梯度洗脱
表1 洗脱梯度条件
柱温：30 ℃
流速：1.0 mL/min
进样量：20 μL
七、实验结果
1、添加水平为0.5mg/kg猪肉基质中四种硝基呋喃代谢物衍生物的添加回收结果
表2 添加水平为0.5mg/kg猪肉基质中四种硝基呋喃代谢物衍生物的添加回收结果
表3 W品牌同型号柱，添加水平为0.5mg/kg猪肉基质中四种硝基呋喃代谢物衍生物的添加回收结果
2、添加水平为0.5mg/kg猪肉基质中四种硝基呋喃代谢物衍生物的紫外检测色谱图
图1 添加水平为0.5mg/kg猪肉基质中四种硝基呋喃代谢物衍生物的紫外检测色谱图
本方法回收率和RSD满足标准要求。