一、实验目的
本研究利用固相萃取法作为样品的前处理方法,HPLC法作为分析方法,检测水产品中孔雀石绿含量。该方法可简化样品的前处理过程,节省有机溶剂的使用,操作简便。
二、实验目标物
孔雀石绿(CAS:569-64-2)
三、应用范围
本方法适用于水产品中孔雀石绿的检测的HPLC检测及确证。
四、参考标准
《NY/T 1756-2012 饲料中孔雀石绿的测定》。
五、实验材料
biocomma® Copure® 中性氧化铝固相萃取柱1g/3mL(Cat.No.COALN31000)、biocomma® Copure®PRS固相萃取柱500mg/3mL(Cat.No.COPRS3500)。
六、实验方法
1、样品提取
准确称取样品5.0 g于50 mL离心管中加入1.5 mL 20%的盐酸羟胺,1.0 mol/L的对甲苯磺酸2 mL,5.0 mL乙酸钠-对甲苯磺酸缓冲液(pH=4.5),加入20 mL乙腈,加入2 g中性氧化铝,震荡2 min,超声30 min,离心机离心5 min(4000 r/min),取上清液转移至分液漏斗中。加入20 mL乙腈至离心管中,重复上述提取一次,合并乙腈层。分液漏斗中加入50 mL氯化钠,50 mL二氯甲烷,震摇10 s,静置分层,取二氯甲烷层于梨形瓶中。继续用20 mL二氯甲烷重复上述提取一次,合并两次提取的二氯甲烷层。梨形瓶35 ℃旋转蒸发至近干,再用5 mL乙腈溶解,备用。
2、SPE柱净化
(1)活化:按照中性氧化铝柱在上,PRS柱在下顺序将两柱串联,固相萃取柱使用前使用5 mL乙腈活化。
(2)上样和洗脱:将备用液转移至中性氧化铝柱中净化,梨形瓶使用2.5 mL×2的乙腈洗涤瓶两次,洗涤液转移至中性氧化铝柱内,最后取5 mL乙腈洗涤小柱,保持流速1 mL/min。再弃去流出液,弃去中性氧化铝柱,PRS柱使用2 mL乙腈-乙酸钠缓冲液(6:4, v/v)、1 mL 20%盐酸羟胺-甲醇溶液(1:99, v/v)洗脱,收集洗脱液。
(3)重新溶解:洗脱液用乙腈-乙酸钠缓冲液(6:4, v/v)定容到3 mL,过0.45 μm滤膜,待上机测试。
3、HPLC条件
设 备:Waters Alliance 2695
色谱柱 :Welch Ultimate XB-C18 (4.6×250 mm,5 μm)
检测器 :Waters 2487 紫外检测器
流动相:A:乙腈 B:0.05mol/L乙酸铵缓冲溶液
洗脱方式:梯度洗脱
表1 梯度洗脱条件
流速:1.2 mL/min
检测波长:618 nm
进样体积:50 μL
七、实验结果
1、 0.3mg/kg鱼肉基质中孔雀石绿的添加回收结果
表2 0.3mg/kg鱼肉基质中孔雀石绿的添加回收结果
2、 添加水平为0.3mg/kg鱼肉中孔雀石绿检测色谱图
图1 添加水平为0.3mg/kg鱼肉中孔雀石绿检测色谱图
本方法回收率和RSD满足标准要求。