一、实验目的

本研究利用固相萃取法作为样品的前处理方法,HPLC法作为分析方法,检测水产品中孔雀石绿含量。该方法可简化样品的前处理过程,节省有机溶剂的使用,操作简便。

二、实验目标物

孔雀石绿(CAS:569-64-2) 。

三、应用范围

本方法适用于水产品中孔雀石绿的检测的HPLC检测及确证。

四、参考标准

《GB/T 19857-2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》。

五、实验材料

biocomma® Copure® 酸性氧化铝固相萃取柱1000mg/3mL(Cat. No. COALA31000)。

六、实验步骤

1、样品提取
准确称取鱼肉样品5.0 g于50 mL离心管1中, 加入1.5 mL 20%的盐酸羟胺,2.5 mL 1.0 mol/L的对甲苯磺酸溶液, 5.0 mL乙酸钠-对甲苯磺酸缓冲液(4.95 g无水乙酸钠及0.95 g 对-甲苯磺酸于950ml水中,用乙酸调pH至 4.5,用水定容至1 L),匀浆机均质30 s(10000 r/min)。加入10 mL乙腈,剧烈振摇30 s。加入5 g酸性氧化铝,震荡30 s。离心机离心10 min(3000 r/min),取上清液转移至预先加好10 mL水、2 mL二甘醇的离心管2中。加入10 mL乙腈至离心管1中,重复上述提取一次,合并乙腈层。
离心管2中加入15 mL二氯甲烷,振荡10 s,离心10 min(3000 r/min),取二氯甲烷层于梨形瓶中。继续用5 mL乙腈、10 mL二氯甲烷重复上述提取一次,合并两次提取的二氯甲烷层。将提取液45 ℃旋转蒸发至1 mL,再用2.5 mL乙腈溶解,待净化。

2、SPE柱净化
(1) 活化:酸性氧化铝固相萃取柱使用前用5 mL乙腈活化。
(2) 上样和洗脱:将梨形瓶中的待净化液转移至柱中净化,梨形瓶使用2.5 mL×2的乙腈洗涤瓶两次,把洗涤液依次通过柱子,整个上样过程保持流速不超过0.6 mL/min,收集全部流出液。
(3) 重新溶解:流出液45 ℃氮吹至近干,用1 mL乙腈定容,过0.45 μm滤膜,待上机测试。

3、HPLC条件
设 备:Waters Alliance 2695
色谱柱 :Welch Ultimate XB-C18 (4.6×250 mm,5μm)
检测器 :Waters 2487 紫外检测器
流动相:A:乙腈
B:0.05 mol/L乙酸铵缓冲溶液
洗脱方式:梯度洗脱
表1 梯度洗脱条件


流速:1.2 mL/min
检测波长:618 nm
进样体积:50 μL

七、实验结果

1、0.1 mg/kg鱼肉中孔雀石绿的添加回收结果
表2 0.1mg/kg鱼肉中孔雀石绿的添加回收结果


2、 添加水平为0.1 mg/kg鱼肉中孔雀石绿检测的液相色谱图


图1 添加水平为0.1 mg/kg鱼肉中孔雀石绿检测的液相色谱图

本方法回收率和RSD满足标准要求。

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