一、实验目的
本研究利用固相萃取法作为样品的前处理方法，HPLC法作为分析方法，检测水产品中孔雀石绿含量。该方法可简化样品的前处理过程，节省有机溶剂的使用，操作简便。
二、实验目标物
孔雀石绿(CAS:569-64-2)
三、应用范围
本方法适用于水产品中孔雀石绿的检测的HPLC检测及确证。
四、参考标准
《NY/T 1756-2012 饲料中孔雀石绿的测定》。
五、实验材料
biocomma® Copure® 中性氧化铝固相萃取柱1g/3mL(Cat.No.COALN31000)、biocomma® Copure®PRS固相萃取柱500mg/3mL(Cat.No.COPRS3500)。
六、实验方法
1、样品提取
准确称取样品5.0 g于50 mL离心管中加入1.5 mL 20%的盐酸羟胺，1.0 mol/L的对甲苯磺酸2 mL，5.0 mL乙酸钠-对甲苯磺酸缓冲液(pH=4.5)，加入20 mL乙腈，加入2 g中性氧化铝，震荡2 min，超声30 min，离心机离心5 min(4000 r/min)，取上清液转移至分液漏斗中。加入20 mL乙腈至离心管中，重复上述提取一次，合并乙腈层。分液漏斗中加入50 mL氯化钠，50 mL二氯甲烷，震摇10 s，静置分层，取二氯甲烷层于梨形瓶中。继续用20 mL二氯甲烷重复上述提取一次，合并两次提取的二氯甲烷层。梨形瓶35 ℃旋转蒸发至近干，再用5 mL乙腈溶解，备用。
2、SPE柱净化
(1)活化：按照中性氧化铝柱在上，PRS柱在下顺序将两柱串联，固相萃取柱使用前使用5 mL乙腈活化。
(2)上样和洗脱：将备用液转移至中性氧化铝柱中净化，梨形瓶使用2.5 mL×2的乙腈洗涤瓶两次，洗涤液转移至中性氧化铝柱内，最后取5 mL乙腈洗涤小柱，保持流速1 mL/min。再弃去流出液，弃去中性氧化铝柱，PRS柱使用2 mL乙腈-乙酸钠缓冲液(6:4, v/v)、1 mL 20%盐酸羟胺-甲醇溶液(1:99, v/v)洗脱，收集洗脱液。
(3)重新溶解：洗脱液用乙腈-乙酸钠缓冲液（6:4, v/v）定容到3 mL，过0.45 μm滤膜，待上机测试。
3、HPLC条件
设 备：Waters Alliance 2695
色谱柱 ：Welch Ultimate XB-C18 (4.6×250 mm，5 μm)
检测器 ：Waters 2487 紫外检测器
流动相：A:乙腈 B:0.05mol/L乙酸铵缓冲溶液
洗脱方式：梯度洗脱
表1 梯度洗脱条件
流速：1.2 mL/min
检测波长：618 nm
进样体积:50 μL
七、实验结果
1、 0.3mg/kg鱼肉基质中孔雀石绿的添加回收结果
表2 0.3mg/kg鱼肉基质中孔雀石绿的添加回收结果
2、 添加水平为0.3mg/kg鱼肉中孔雀石绿检测色谱图
图1 添加水平为0.3mg/kg鱼肉中孔雀石绿检测色谱图
本方法回收率和RSD满足标准要求。