一、实验目的
本研究利用固相萃取法作为样品的前处理方法，HPLC法作为分析方法，检测水产品中孔雀石绿含量。该方法可简化样品的前处理过程，节省有机溶剂的使用，操作简便。
二、实验目标物
孔雀石绿(CAS:569-64-2) 。
三、应用范围
本方法适用于水产品中孔雀石绿的检测的HPLC检测及确证。
四、参考标准
《GB/T 19857-2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》。
五、实验材料
biocomma® Copure® 酸性氧化铝固相萃取柱1000mg/3mL(Cat. No. COALA31000)。
六、实验步骤
1、样品提取
准确称取鱼肉样品5.0 g于50 mL离心管1中， 加入1.5 mL 20%的盐酸羟胺，2.5 mL 1.0 mol/L的对甲苯磺酸溶液， 5.0 mL乙酸钠-对甲苯磺酸缓冲液（4.95 g无水乙酸钠及0.95 g 对-甲苯磺酸于950ml水中，用乙酸调pH至 4.5，用水定容至1 L），匀浆机均质30 s（10000 r/min）。加入10 mL乙腈，剧烈振摇30 s。加入5 g酸性氧化铝，震荡30 s。离心机离心10 min（3000 r/min）,取上清液转移至预先加好10 mL水、2 mL二甘醇的离心管2中。加入10 mL乙腈至离心管1中，重复上述提取一次，合并乙腈层。
离心管2中加入15 mL二氯甲烷，振荡10 s，离心10 min（3000 r/min），取二氯甲烷层于梨形瓶中。继续用5 mL乙腈、10 mL二氯甲烷重复上述提取一次，合并两次提取的二氯甲烷层。将提取液45 ℃旋转蒸发至1 mL，再用2.5 mL乙腈溶解，待净化。
2、SPE柱净化
(1) 活化：酸性氧化铝固相萃取柱使用前用5 mL乙腈活化。
(2) 上样和洗脱：将梨形瓶中的待净化液转移至柱中净化，梨形瓶使用2.5 mL×2的乙腈洗涤瓶两次，把洗涤液依次通过柱子，整个上样过程保持流速不超过0.6 mL/min，收集全部流出液。
(3) 重新溶解：流出液45 ℃氮吹至近干，用1 mL乙腈定容，过0.45 μm滤膜，待上机测试。
3、HPLC条件
设 备：Waters Alliance 2695
色谱柱 ：Welch Ultimate XB-C18 (4.6×250 mm，5μm)
检测器 ：Waters 2487 紫外检测器
流动相：A：乙腈
B：0.05 mol/L乙酸铵缓冲溶液
洗脱方式：梯度洗脱
表1 梯度洗脱条件
流速：1.2 mL/min
检测波长：618 nm
进样体积:50 μL
七、实验结果
1、0.1 mg/kg鱼肉中孔雀石绿的添加回收结果
表2 0.1mg/kg鱼肉中孔雀石绿的添加回收结果
2、 添加水平为0.1 mg/kg鱼肉中孔雀石绿检测的液相色谱图
图1 添加水平为0.1 mg/kg鱼肉中孔雀石绿检测的液相色谱图
本方法回收率和RSD满足标准要求。