一、实验目的
本研究利用固相萃取法作为样品的前处理方法，HPLC法作为检测手段。该方法可简化样品的前处理过程，节省有机溶剂的使用，操作简便。
二、实验目标物
己烯雌酚(CAS:56-53-1)。
三、应用范围
本方法适用于奶制品中己烯雌酚HPLC检测及确证。
四、参考标准
《GB/T 22992-2008 牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》。
五、实验材料
biocomma® Copure® MAX固相萃取柱60mg/3mL(Cat.No.COMAX360)。
六、实验方法
1、样品提取
取5 mL牛奶样品，置于离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋混合3 min，3500 r/min离心10 min，取上清液于离心管中，再向样品中加入5 mL乙腈，同前操作，合并提取液，50 ℃下氮吹至体积小于0.1 mL，加水10 mL，用5 mol/L NaOH 调节pH至11.0，4 ℃，9000 r/min离心5 min，备用。
2、SPE柱净化
(1)活化：加入2 mL甲醇、2 mL水活化。
(2)上样和洗脱：将样品上清液上柱，流速为1 mL/min，依次用1 mL 氨水-水(1:19, v/v)，0.5 mL甲醇以3 mL/min的流速淋洗，弃去淋洗液，用4 mL甲酸-甲醇(1:19, v/v)洗脱，流速为 1 mL/min，收集洗脱液。
(3)重新溶解：洗脱液于40 ℃氮吹至吹干，加入1 mL流动相，涡旋30 s溶解。过0.22 μm滤膜后，用于HPLC测定。
3、HPLC条件
设备：Waters Alliance 2695
检测器：Waters 2487 双波长检测器；检测波长：245 nm
色谱柱：Welch Ultimate XB-C18 (4.6X250mm)
流动相：A：0.1%甲酸水
B：甲醇
洗脱方式：等度洗脱, A : B=30 : 70
流速：1 mL/min
进样体积：20 μL
柱温：室温
七、实验结果
1、牛奶基质加标回收结果
表1 牛奶中0.2mg/kg加标回收实验结果
2、 添加水平为0.2mg/kg牛奶基质中乙烯雌酚检测色谱图
图1 添加水平为0.2mg/kg牛奶基质中乙烯雌酚检测色谱图
本方法回收率和RSD满足标准要求。