苯甲酸和山梨酸的介绍
苯甲酸为具有苯或甲醛气味的鳞片状或针状结晶，微溶于水，易溶于乙醇、乙醚等有机溶剂，它的蒸气有很强的刺激性，吸入后易引起咳嗽。苯甲酸主要用于抗真菌及消毒防腐，用于医药、染料载体、增塑剂、香料和食品防腐剂等的生产，也用于醇酸树脂涂料的性能改进 ，也可作为钢铁设备的防锈剂、农业化学品。
山梨酸，为白色针状或粉末状晶体，对酵母、霉菌和许多真菌都具有抑制作用，是高效无毒防腐防霉剂，也是一种公认安全高效的食品添加剂。山梨酸主要用于人类食品、动物饲料、化妆品、医药、包装材料和橡胶助剂等。在西方发达国家的应用量很大，但在中国国内的应用范围还不广。山梨酸及钾盐在我国食品行业的应用必将会越来越广泛。
有关苯甲酸和山梨酸的安全限量标准
根据国标GB2760-2014食品添加剂使用标准苯甲酸腌制品中最大添加量为1.0g/kg
山梨酸在腌制品制品中最大添加量为1.5g/kg;逗点生物开发出使用SPE方法检测咸鸭蛋中苯甲酸和山梨酸的含量，平均回收率80%以上，为客户提供关于检测苯甲酸和山梨酸有效的解决方案。
一、实验目的
本研究利用固相萃取法作为样品的前处理方法，HPLC法作为分析方法，检测咸鸭蛋中苯甲酸山梨酸的含量。该方法可简化样品的前处理过程，节省有机溶剂的使用，操作简便。
二、实验目标物
苯甲酸 (CAS:65-85-0)；山梨酸（CAS：110-44-1）
三、应用范围
本方法适用于咸鸭蛋中苯甲酸山梨酸的检测的HPLC检测及确证。
四、参考标准
《GB/T 23495-2009 食品中苯甲酸和山梨酸的测定 高效液相色谱法》
五、实验材料
biocomma® Copure® MAX固相萃取柱60 mg/3 mL ；咸鸭蛋（熟）
六、实验方法
1、样品提取
准确称取样品10.0 g于50 mL离心管中加入水溶液（v/v）21 mL，准确加入0.25 mol/L的亚铁氰化钾溶液2 mL、1mol/L的乙酸锌溶液2 mL，涡旋混匀，超声提取10 min，振荡提取10 min。4500 r/min离心5 min，取上清液5 mL备用。
2、SPE柱活化
MAX固相萃取柱使用前用3 mL甲醇、3 mL水活化 。
3、上样和洗脱
在MAX固相萃取柱上加入备用样液，弃去流出液； 用3 mL 2%氨水水溶液（v/v）、3 mL甲醇淋洗，弃去淋洗液；抽干小柱；用5%甲酸甲醇溶液（v/v）5 mL洗脱，收集洗脱液（整个上样、洗脱过程保持流速1 mL/min） 。
4、上机测试
洗脱液氮吹至2 mL以下，用甲醇定容至2 mL过0.45 μm滤膜，上机测试。
5、HPLC条件
设 备：Waters Alliance 2695
色谱柱 ：Welch Ultimate XB-C18 (4.6×250mm)
检测器 ：Waters 2487 紫外检测器
流动相：A乙腈 B磷酸盐缓冲溶液
（磷酸盐缓冲液：称取磷酸二氢钾2.5 g+磷酸氢二钾2.5 g，加水溶解定容到1000 mL）
梯度洗脱见表1
流速：1.0 mL/min
检测波长：230 nm
进样体积:20 μL
七、实验结果
1、10 mg/kg咸鸭蛋基质中苯甲酸山梨酸的添加回收结果
表2 10 mg/kg咸鸭蛋基质中苯甲酸山梨酸的添加回收结果
2、添加水平为10 mg/kg苯甲酸山梨酸标准色谱图
图1 添加水平为10 mg/kg苯甲酸山梨酸标准色谱图
结论：咸鸭蛋中苯甲酸山梨酸检测的平均回收率大于80%，RSD小于3.7%。