据央视新闻客户端,当地时间10月22日,美国疾病控制与预防中心(CDC)警告称,麦当劳的“四分之一磅汉堡包”在美国多州引发与大肠埃希氏菌相关的疾病。疾控中心在一份报告中表示,美国目前有49人因食用“四分之一磅汉堡包”而患病,疾控中心已就此展开调查。本次新闻报道中的主角——大肠埃希氏菌,属于肠杆菌科埃希菌属,常习惯被称为大肠杆菌。该菌主要存在于人和动物的肠道中,随粪便排出分布于自然界中。大肠埃希氏菌是条件致病菌,在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道或尿道等多种局部组织器官感染。今天小编分享一篇关于大肠埃希氏菌的检验标准。

1、增菌

以无菌操作取检样25 g(或25 mL)加入到含有225 mL mEC+n肉汤的均质袋中,在拍击式均质器上连续均质 1 min~2 min。36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h。

图1  空白mEC+n肉汤(澄清)
图2  增菌后的mEC+n肉汤(浑浊)

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2、分离

取增菌后的mEC+n肉汤,划线接种于CT-SMAC平板和大肠埃希氏菌O157 显色平板上,36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h,观察菌落形态。在 Aiculture® CT-SMAC平板上,典型菌落为圆形、光滑的无色菌落,中心呈现较暗的灰褐色。

图3  CT-SMAC平板上的典型O157菌落

在Aiculture®大肠埃希氏菌O157 显色平板上,典型菌落为圆形、光滑的品(紫)红色菌落。

图4  大肠埃希氏菌O157 显色平板上的典型O157菌落

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      在Aiculture®大肠埃希氏菌O157 显色平板上,典型菌落为圆形、光滑的品(紫)红色菌落。

3、 初步生化试验

      在CT-SMAC和大肠埃希氏菌O157 显色平板上分别挑取5个~10 个可疑菌落,接种TSI琼脂,于36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h。在TSI琼脂中,典型菌株为斜面与底层均呈黄色,产气或不产气,不产生硫化氢(H2S)。

图5  大肠埃希氏菌O157 在TSI 琼脂中的特征

      同时接种 MUG-LST肉汤,并用大肠埃希氏菌株(ATCC25922或等效标准菌株)做阳性对照,大肠埃希氏菌 O157:H7(NCTC12900 或等效标准菌株)做阴性对照,于36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h。置MUG-LST 肉汤管于366 nm紫外灯下观察,MUG 阳性的大肠埃希氏菌株应有荧光产生,MUG阴性的应无荧光产生。

图6  Aiculture® MUG-LST肉汤生长情况

     大肠埃希氏菌 O157:H7/NM 为 MUG 试验阴性,在MUG-LST 肉汤中无荧光产生。

图7  Aiculture® MUG-LST肉汤在紫外灯等的典型特征

必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色。挑取可疑菌落,在营养琼脂平板上分纯,于36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h,并进行下列鉴定。

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4. 鉴定

4.1 血清学试验

在营养琼脂平板上挑取分纯的菌落,用O157和 H7诊断血清或O157乳胶凝集试剂作玻片凝集试验。

4.2 生化试验

4.2.1 从营养琼脂平板上挑取菌落,进行生化试验。大肠埃希氏菌O157:H7/NM 生化反应特征见表 1。

表1  大肠埃希氏菌O157:H7/NM 生化反应特征

4.2.2 从营养琼脂平板上挑取菌落,用稀释液制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统进行鉴定。

4.3 毒力基因测定(可选项目)

当样品中检出大肠埃希氏菌O157:H7 或O157:NM 时,如需要进一步检测Vero 细胞毒素基因的存在,可通过接种Vero 细胞或HeLa细胞,观察细胞病变进行判定;也可使用基因探针检测或聚合酶链反应(PCR)方法进行志贺毒素基因(stx1、stx2)、eae、hlv 等基因的检测。

5、 结果报告

      综合生化和血清学试验结果,报告25 g(或25 mL)样品中检出或未检出大肠埃希氏菌 O157:H7或大肠埃希氏菌O157:NM。

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